皆さんご存知のように、山中先生により人工多能性幹細胞（iPS細胞）が発見され、再生医療に応用することが期待されています。実際に患者へ移植する臨床研究が行われ、新しい治療技術として選択できるようになりつつあります。では、再生医療の究極的な目標は何でしょうか？それは、ヒトの組織や臓器を体の外で再構築して患者さんに移植することです。また、ヒトの組織や臓器を再現できると、病気の治療薬の開発にも応用することができます。現在は実験動物が用いられていますが、ヒトと動物の種差により、得られた結果がヒトと一致しないことが課題となっています。また、動物愛護の観点からも実験動物に代わる手法の開発が求められています。

　生体の組織や臓器は、「細胞」と細胞が接着するための足場である「細胞外マトリックス（ECM）」というタンパク質で構成されています。細胞と人工的な足場材料を組み合わせて組織や臓器の構造を再現する技術を「組織工学」と呼びます（図1）。これまで様々な組織工学技術が開発されてきましたが、主に組織形状の再現に注目して研究されてきたため、最も重要な「組織機能の再現」は困難でした。

　私たちは、この課題を解決するため生体の組織構造ができる過程に着目しました。生体では、細胞がECMに接着し、自分でもECMを産生しながら増殖と分化を繰り返すことで複数種類の細胞が秩序だった構造を構築しています。そこで、細胞とECMを協同的に育てることで、生体組織のように秩序だった立体構造を有する組織体が構築できるのでは、と考え、「協同的組織工学」という新しい概念を考案しました。以下、三つの研究項目を段階的に研究することで概念の実証に取り組みました。

　組織形状の再現に注目して研究すると、なぜ組織機能を再現することが難しいのでしょうか？これは、細胞はわずか直径15 mmの粒子であるため、細胞だけでセンチメートルサイズの組織構造を作ることは困難だからです。そのため、組織構造の造形には足場材料が必要となります。しかし、足場材料の量が多くなると足場材料が細胞と他の細胞の隙間を埋めてしまうため細胞が孤立し、細胞同士が相互作用できなくなります。細胞は、他の細胞と接着して相互作用することで機能を発現することができます。つまり、細胞は一人では機能を示すことができず、他の仲間と一緒に細胞集団を形成することで初めて機能を発現できるようになります。

では、足場材料が少なすぎるとどうでしょうか？足場材料が無いと細胞は無秩序なただの凝集体となり、内部の細胞に栄養や酸素が届きにくくなるため内部細胞が死んでしまいます。そのため、およそ200 mm以上の大きさの秩序だった組織構造は得られません。このジレンマを解消し、「センチメートルサイズの機能する組織体」を実現するためには、新しい原理に基づいた組織工学技術が必要でした（図2）。

　細胞集積法で形成されたナノ足場材料は細胞－細胞間の接着の誘起には適していましたが、細胞の配向や分化誘導を制御することは困難でした。細胞の配向を誘導するためには、「①細胞接着性」と「②直径数μm、長さ数百μm以上の線維」の両方の性質を有する足場材料が必要と考え、ECM成分であるコラーゲンを平均長さ200 μmに解繊したコラーゲンマイクロファイバー（CMF）を作製し、CMFを細胞と混合して培養容器の中で培養する「沈殿培養法」を新たに考案しました（図4a）。CMFの量に依存して組織体中のコラーゲン密度（硬さ）を制御可能であり、血管平滑筋組織体や脂肪組織、血液脳関門ネットワークなど、各組織の分化や成熟化に最適な硬さに調節することができました。また、3Dプリント時のせん断応力によりCMFを配向させることで、CMFの配向に依存して毛細血管網を配向できることを見出しました。

　これらの知見を踏まえ、より一軸配向性が重要な筋組織の構築に取り組みました。筋肉組織は、直径50 ~ 100 μmの筋線維の集合体です。特に、私たちが食べている和牛肉は、筋線維の間に脂肪線維が入った霜降り構造になっています。そこで、ウシの細胞を用いて筋線維と脂肪線維を作製し、金太郎飴の方法で各線維の配置を制御して束ねることで和牛肉の霜降り組織を再現する研究に取り組みました。直径1 mm以下の筋線維や脂肪線維を手作業で作製することは極めて難しいため、3Dプリンターを用いて各線維を作製することにしました。

　和牛肉から筋線維に分化する幹細胞であるサテライト細胞と、脂肪細胞や血管内皮細胞に分化する脂肪由来幹細胞をそれぞれ採取し、フィブリンゲルにCMFを組み合わせて共に3Dプリンターで垂直方向にプリントすることで、直径0.5 ~ 1.0 mm、長さ1.5 cmの各線維を作製できました。3Dプリント時のせん断応力によりCMFが一軸配向するため、それに従って筋管や脂肪細胞が細胞集団として一軸配向性を示すことを見出しました。得られた42本の筋線維と28本の脂肪線維、2本の毛細血管線維の合計72本を束ねることで、1.0 cm四方、厚さ1.5 cmの霜降り構造を有する和牛培養肉の作製に世界で初めて成功しました（図4b）。本手法は、霜降りの量や構造をテーラーメイドで制御することができるため、消費者の好みや体調に応じて自分の好きな培養肉を作製できる革新的な技術です。

　以上より、CMFを用いた沈殿培養法組織体の硬さや配向の制御が可能であり、細胞集団の分化や成熟、配向、移動に最適な条件を見出すことに成功しました。

図4. CMFを用いた沈殿培養法による毛細血管の配向制御（a）

　　　および3Dプリントにより細胞の一軸配向性を制御した筋組織、脂肪線維、血管線維を束ねて作製された和牛培養肉（b）

　2の結果より、数百μmの長さを有するCMFが細胞集団の分化や配向の制御に適していることが明らかになりましたが、本手法にも限界がありました。CMFの長さは200 μm（0.2 mm）と短く、3Dプリント時のフィブリンゲル溶液にそれぞれのCMFが孤立して分散しているため全てのCMFを同じ方向に均一に配向させることが難しく、作製できる筋線維は1.5 cm程度の長さが限界でした。より長い一軸配向組織体を作製するためには更なる技術改善が必要でした。そこで、細胞集積法のようなナノ足場材料が細胞と共にミリメートルからセンチメートルサイズに成長し、細胞の分化や配向をより高度に制御できれば理想的な協同的組織工学が実現できると考え、細胞集積法の改善に取り組みました。

　様々なECM成分の組み合わせをスクリーニングした結果、コラーゲンとヘパリンを細胞と組み合わせることで、わずか1分間混合して沈殿させるだけで90%以上の高収率で細胞表面に粘性のナノ足場材料を形成できることを見出しました（図5a）。Cell assembled viscous tissues （CAViTs）と名付けた本手法は、簡便に毛細血管を有する組織体を構築可能であり、患者がん細胞の培養と薬剤応答評価に応用できることを見出しました。
　さらにスクリーニングすることで、ある高分子をコラーゲンと混合すると液－液相分離によりさらに強い粘性ナノ足場材料が形成され、それを引っ張ることで数十cm以上の紡糸ができることを見出しました。顕微鏡観察の結果、直径約5 mmのコラーゲンの微細線維が多数集合して一軸配向し、直径約500 mm ~ 1 mmのコラーゲン線維を形成していることが分かりました。このコラーゲン線維の形成は細胞存在下でも可能であり、ウシサテライト細胞共存下で線維形成することで線維の隙間に接着した細胞が増殖しながら分化誘導し、一軸方向に高度に配向した筋線維を10 cm以上作製できることを見出しました（図5b）。また、細胞の増殖と筋線維形成の過程でコラーゲン線維がより密に集合し、一軸配向性が高まることも分かりました。この「成長する足場材料」により、細胞と材料が協同的に組織体を構築する「協同的組織工学」を実験的に証明することができました。

　以上のように、私たちは、1.ナノ足場材料が細胞－細胞間の接着と細胞集団の形成に有用であること、2.マイクロ足場材料の硬さと配向が細胞集団の配向や分化、移動の制御に有用であることを見出し、3.それら両方の性質を満たした革新的な「成長する足場材料」を創製することで協同的組織工学という独創的な概念を提案し、センチメートルサイズの機能する組織体を達成しました。本成果を通じて示された協同的組織工学という概念は、再生医療分野や創薬分野だけでなく食品分野など様々な分野に大きな波及効果を示し、世界的にも高い評価を受けています。

　本研究は独創的な新規概念に基づく基礎研究ですが、実用化への可能性が高く、社会実装を目指して様々な企業と下記の共同研究を行っています。

・一軸配向筋線維や脂肪線維は培養肉に展開しています。2023年3月29日に「培養肉未来創造コンソーシアム」（15社、2024年9月現在）を設立し、大阪・関西万博において大阪ヘルスケアパビリオンで半年間の常設展示が決定しています。また、新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）のプロジェクトにより2030年頃の社会実装を目指して研究開発に取り組んでいます。

・CAViTs法による患者がん細胞の培養は、がん個別化医療を目指した薬剤感受性試験へ応用し、2023年6月より大阪大学－TOPPANホールディングス－がん研究会の共同研究により臨床試験を開始しました。

・沈殿培養法による血液脳関門モデルは中枢神経薬の透過性試験へ応用し、日本医療研究開発機構（AMED）のプロジェクトにより大阪大学－医薬品食品衛生研究所－医薬基盤・健康・栄養研究所－SCREENホールディングスの共同研究により2026年頃の事業化を目指しています。

　これらの研究成果は、持続可能性が問われる現代社会の多様なニーズに合致しており、今後更なる応用展開が期待されています。